Ana María Estupiñan se interesó en el mundo del entretenimiento desde su infancia. A los 12 años ingresó en una academia del canal Caracol y participó en comerciales junto con sus hermanos. En 2008 debutó como actriz en la famosa serie de televisión colombiana Oye bonita. Más tarde, se consagró como uno de los talentos jóvenes de la televisión colombiana gracias a su papel como la heroína de la independencia colombiana Policarpa Salavarrieta (en su etapa joven) en la telenovela La Pola (2010). Siguió su carrera con otros papeles importantes como la joven Helenita Vargas, en la serie basada en la cantante llamada La ronca de oro (2014). En 2020 interpretó el papel de Irene Toro en Amar y vivir, una serie de televisión colombiana producida por Fox Telecolombia para Caracol Televisión. Estupiñan protagoniza Rigo (2023), serie que cuenta la historia del ciclista en ruta profesional Rigoberto Urán.