El primer papel regular de Nathan Fillion fue en One life to live (1968), como Joey Buchanan, por cuyo papel fue nominado en 1996 para un Daytime Emmy Award. A fines de la década de 1990, apareció en pequeños papeles en las películas y volvió a llamar la atención en 1998, cuando fue elegido como Johnny Donnelly en la segunda temporada de Two Guys and a Girl (1998). Cuando esta serie terminó en 2001, Fillion ganó elogios de la crítica y un gran culto de fanáticos cuando interpretó al Capitán Malcolm Reynolds en la serie de fantasía Firefly de Joss Whedon, así como en su continuación cinematográfica Serenity (2005). En 2009, fue elegido como el personaje principal Richard Castle en la exitosa serie de televisión de ABC, Castle, que lo llevó a ganar cuatro premios People's Choice Awards para el actor de televisión dramático favorito. Actualmente se encuentra en las grabaciones de The Suicide Squad (2021), en un personaje que aún no ha sido revelado.