Eugene Levy comenzó su carrera como parte de la serie de sketch de comedia Second City Television, donde a menudo interpretó personajes de apoyo inusuales y hacia imitaciones de celebridades. Quizás su papel más conocido es el de Earl Camembert, un periodista de noticias de "SCTV News" y una parodia del periodista canadiense de la vida real Earl Cameron. Levy es un colaborador habitual del actor y director Christopher Guest, unión que comenzó con Waiting for Guffman (1996). Como actor es mejor conocido por el papel de Noah Levenstein en la franquicia de American Pie, papel que consolidó su reputación como el padre favorito de Estados Unidos. Además participó en los éxitos de taquilla El padre de la novia Parte II (1995), Bringing Down The House (2003), Más barato por docena 2 (2005) y prestó su voz para el padre de Dory en la cinta animada de Disney/Pixar, Buscando a Dory (2016). En 2019, Levy fue nominado para el Primetime Emmy por Mejor Actor Principal en una Serie de Comedia por la serie Schitt's Creek, su primera nominación como actor en su carrera. En el 2020 Eugene volvió a ser nominado por su papel en Schitt's Creek y ganó en la categoría de Mejor actor en una serie de comedia. Un año después, el actor volvió a ser nominado en la misma categoría, esta vez, en los Globos de Oro 2021.
