Estudiando para médico en la especialidad de psiquiatría, Diego Peretti comenzó a estudiar actuación con Raúl Serrano como un pasatiempo mientras cursaba el segundo año de la facultad. Durante la residencia en el hospital Castex, Peretti comenzó a actuar en teatro. En 1994 empezó a interpretar al Tarta en la serie policial Poliladron. En el segundo año de esta serie, Peretti abandonó definitivamente la psiquiatría para dedicarse a la actuación, y rápidamente hizo su debut cinematográfico en el largometraje El sueño de los héroes, bajo la dirección de Sergio Renán. En 2002, comenzó su exitosa participación en la serie Los simuladores, en la cual interpretaba a Emilio Ravenna y también contribuía con los guiones. Más tarde actuó en la película No sos vos, soy yo (2004), dirigida por Juan Taratuto, por la que ganó el premio al mejor actor en el Festival de Cine de Lérida. Peretti protagoniza la nueva serie de Netflix El reino, creada por Marcelo Piñeyro y Claudia Piñeiro.