Diplomada en Ciencias Políticas, Maria Bello decide dedicarse al mundo del teatro apareciendo en obras como The Killer Inside Me y Smart Town Gals. En 1996, consigue un papel regular en la serie de televisión Mr. & Mrs. Smith, junto a Scott Bakula. Un año después se convierte en la pediatra Anna Del Amico de la ficción televisiva Sala de emergencia. 

Después de trabajar al lado de Ben Stiller y Elizabeth Hurley en el drama Permanent Midnight (1998), de David Veloz, Maria Bello encarna a una prostituta, amante de Mel Gibson, en la cinta Payback (1999). Al año siguiente protagoniza el documental, en formato IMAX, China: La aventura del panda. Gracias a su físico y a su frescura se convierte en la dueña de un pub en la cinta Coyote Ugly (2000); una cantante de karaoke en Duets (2001), e incluso en una actriz de la serie Papa Schultz en Auto Focus.

Tentada por el thriller, Maria Bello encarna a la ex-mujer de Johnny Depp en La ventana secreta (2004), adaptación de una novela de Stephen King; se convierte en protagonista de Asalto al distrito 13 (2005), y se pone a las órdenes de David Cronenberg en Una historia violenta (2005). Tras participar en World Trade Center (2006), de Oliver Stone, regresa a la acción en La momia: la tumba del emperador Dragón (2008), sustituyendo a Rachel Weiss. Dos años después, se une a Adam Sandler en la comedia Son como niños, y protagoniza al lado de Ben Affleck el drama The Company Men.

En 2014, coprotagonizño junto a Frank Grillo la película producida por James Wan, Demoníaco.